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外泌體分離

2023-04-04 13:48:39 179

超速離心方法可以從細胞培養上清液、血清、血漿、尿液、腦脊液以及其他體液(腹水、羊水、乳液以及唾液等)中的提取外泌體,獲取的高純度外泌體顆粒,可進(jìn)行后續的NTA、TEM、WB等分析。 

樣本準備

樣本類(lèi)型

樣本要求

送樣量

血漿樣品

(不能用肝素抗凝)

(1) 用采血針和EDTA抗凝管抽取全血,輕柔上下顛倒混勻后室溫或者4°C保存,并在1小時(shí)內進(jìn)行下一步處理;

(2)  4°C條件下,3000× g離心15min,小心吸取上清,注意避免吸入底部和側面的沉淀物;

(3) 將血漿凍存于-80°C;

提示:送樣量最好4 ml以上(分離4 ml血漿約需要8-10 ml全血)。

>2ml

血清樣品

(有條件的話(huà)盡量采用血漿,避免血小板來(lái)源的外泌體影響)

(1) 用采血針和普通采血管(不含抗凝劑,10ml規格)采血10 ml;

(2) 室溫靜置 30 min,然后4°C條件下,靜置3-4小時(shí)(此時(shí)可見(jiàn)血塊析出);

(3) 用移液器吸取上面的淡黃色血清(應該有4 ml左右)轉入15 ml離心管中,4°C條件下 3000g離心15min,小心取上清轉入新的離心管中;

(4) 將血清樣品置于-80°C保存;

提示:送樣量最好4 ml以上(分離4 ml血清約需要10-15ml全血)。

>2ml

細胞上清

(需采用去除外泌體的培養基)

細胞培養基必須使用去除 exosome的血清或者無(wú)血清培養基,以降低背景值的干擾(牛血清中含有大量牛源外泌體)。

 

(1) 細胞在正常含有血清的培養基中培養一定時(shí)間,貼壁細胞密度在70 %-80 %,懸浮細胞密度在60 %-70 %;

(2) 對于貼壁細胞,去除原有培養基,換為新的不含外泌體的培養基或者無(wú)血清培養基;對于懸浮細胞,300 g,4°C,10 min收集細胞;

(3) 使用不含外泌體的培養基或者無(wú)血清培養基懸浮細胞并繼續培養。細胞繼續培養24-48 小時(shí),根據細胞的生長(cháng)速度確定收取上清時(shí)間;

(4) 收集細胞上清,300 g,4°C,離心10 min;小心吸取上清,注意避免吸入細胞或者細胞碎片;

(5)  3000 g,4°C,再次離心15 min,確保將細胞或者細胞碎片去除干凈;

(6) 上清0.22μm過(guò)濾,去除細胞碎片、凋亡小體和微囊泡;

(7) 上清可在4°C短期保存(1-2天),長(cháng)期保存可凍存于-80°C 。建議細胞上清分離后盡快進(jìn)行外泌體分離,保存在4°C-80°C,都會(huì )對產(chǎn)量有一定的影響。

>20ml

尿液

(1) 無(wú)菌容器采集前/中后段晨尿100ml,并注意避免細菌污染,收集前注意對飲食的控制,于4℃臨時(shí)保存(不得超過(guò)8 h);

加入蛋白酶抑制劑混合物(1.67 ml of100mM NaN3, 2.5ml PMSF (2 mg/ml in isopropyl alcohol), 50 μl Leupeptin (1 mg/ml in ddH2O));

(2) 并于3000×g離心15min,去除細胞或細胞碎片;

(3)  -80℃冰箱中保存。

>20ml

腦脊液

(1) 收集腦脊液10ml,采集方式為腰椎穿刺,樣本一經(jīng)分離,請務(wù)必立即置于冰上或4℃短暫保存(不得超過(guò)4 h,避免受到血液污染,勿使用含肝素抗凝劑的采樣管收集盛放;

(2)  -80℃冰箱中保存。

10ml

胸水

(1) 臨床收集胸水后若不能第一時(shí)間處理,請于4℃臨時(shí)保存(不得超過(guò)8 h);

(2) 將收集到的胸水1000 g離心10 min,收集上清液;

(3) 將得到的胸水上清3000 g離心10 min,收集上清;

(4)  -80℃冰箱中保存。

30ml

腹水

(1) 臨床收集腹水后若不能第一時(shí)間處理,請于4℃臨時(shí)保存(不得超過(guò)8 h);

(2) 將采集到的腹水在4℃下(室溫亦可)離心2000 g,20 min,去除腹水中的殘渣;

(3) -80℃冰箱中保存。

30ml

膽汁

(1) 用無(wú)菌容器收集膽汁;

(2) 將收集到的膽汁在4℃下,3000 g離心10 min去除細胞沉渣和碎片;

(3) 收集膽汁上清液,4℃或者-20℃長(cháng)期保存。

5ml

檢測周期: 

實(shí)驗室收到樣本后10-15個(gè)工作日內完成檢測,提供外泌體抽提步驟和報告。



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